Pour le séquençage de l'ADN

Le domaine de la biotechnologie est celui du changement constant. La croissance rapide et le développement de la recherche de pointe dépendent de l'innovation et de la créativité des scientifiques et de leur capacité à voir le potentiel d'une technique moléculaire de base et à l'appliquer à de nouveaux processus. L'avènement de la PCR a ouvert de nombreuses portes dans la recherche génétique, y compris un moyen d'analyse de l'ADN et l'identification de différents gènes basés sur leurs séquences d'ADN.

Le séquençage de l'ADN dépend également de notre capacité à utiliser l'électrophorèse sur gel pour séparer des brins d'ADN dont la taille diffère d'aussi peu qu'une paire de bases.

Séquençage d'ADN

À la fin des années 1970, deux techniques de séquençage d'ADN pour des molécules d'ADN plus longues ont été inventées. Il s'agissait de la méthode

Sanger (ou didésoxy) et de la méthode Maxam-Gilbert (clivage chimique). La méthode de Maxam-Gilbert est basée sur le clivage des nucléotides par des produits chimiques et est mieux utilisée pour séquencer les oligonucléotides (polymères nucléotidiques courts, généralement de longueur inférieure à 50 paires de bases). La méthode de Sanger est plus communément utilisée parce qu'elle a été prouvée techniquement plus facile à appliquer et, avec l'avènement de la PCR et l'automatisation de la technique, est facilement appliquée à de longs brins d'ADN incluant certains gènes entiers. Cette technique est basée sur la terminaison de la chaîne par des didésoxynucléotides lors de réactions d'élongation PCR.

Méthode de Sanger

Dans la méthode de Sanger, le brin d'ADN à analyser est utilisé comme matrice et l'ADN polymérase est utilisée, dans une réaction PCR, pour générer des brins complémentaires en utilisant des amorces.

Quatre mélanges réactionnels de PCR différents sont préparés, contenant chacun un certain pourcentage d'analogues de didésoxynucléoside triphosphate (ddNTP) à l'un des quatre nucléotides (ATP, CTP, GTP ou TTP). La synthèse du nouveau brin d'ADN se poursuit jusqu'à ce qu'un de ces analogues soit incorporé, moment auquel le brin est prématurément tronqué.

Chaque réaction PCR finira par contenir un mélange de différentes longueurs de brins d'ADN, se terminant toutes par le nucléotide qui a été marqué au didésoxy pour cette réaction. L'électrophorèse sur gel est ensuite utilisée pour séparer les brins des quatre réactions, dans quatre voies séparées, et déterminer la séquence du modèle original en fonction des longueurs de brins se terminant par quel nucléotide.

Dans la réaction automatisée de Sanger, on utilise des amorces étiquetées avec quatre étiquettes fluorescentes de différentes couleurs. Des réactions de PCR, en présence des différents didésoxy nucléotides, sont effectuées comme décrit ci-dessus. Cependant, ensuite, les quatre mélanges réactionnels sont ensuite combinés et appliqués à une seule voie d'un gel. La couleur de chaque fragment est détectée en utilisant un faisceau laser et les informations sont recueillies par un ordinateur qui génère des chromatogrammes montrant des pics pour chaque couleur, à partir desquels la séquence d'ADN de matrice peut être déterminée.

Typiquement, la méthode de séquençage automatique n'est précise que pour des séquences d'un maximum d'environ 700 à 800 paires de bases. Cependant, il est possible d'obtenir des séquences complètes de gènes plus grands et, en fait, de génomes entiers, en utilisant des méthodes progressives telles que la marche d'amorce et le séquençage Shotgun.

Dans

Primer Walking , une partie exploitable d'un gène plus gros est séquencée à l'aide de la méthode de Sanger. De nouvelles amorces sont générées à partir d'un segment fiable de la séquence et utilisées pour continuer le séquençage de la partie du gène qui était hors de portée des réactions initiales. Le séquençage du fusil

consiste à découper de manière aléatoire le segment d'ADN d'intérêt en fragments de taille plus appropriée (gérables), en séquençant chaque fragment et en agençant les morceaux en fonction des séquences chevauchantes. Cette technique a été facilitée par l'application d'un logiciel informatique pour l'agencement des pièces qui se chevauchent.